Juan de Padilla era hijo de un regidor de Toledo, Pero López de Padilla, que le cedió el cargo en 1518.

Al año siguiente, cuando el rey Carlos I fue elegido Emperador y decidió subir las alcabalas y demás impuestos para financiar su viaje a Alemania y los gastos de la elección, Padilla fue uno de los regidores de Toledo que encabezaron la protesta contra la política fiscal de la Corte inspirada por Chièvres y los ministros flamencos. En febrero de 1520, cuando el Gobierno convocó Cortes en Santiago, Padilla se puso también al frente de los regidores que se oponían a otorgar un nuevo servicio al Rey. Entendiendo que él era uno de los principales promotores de la oposición, el Rey le ordenó salir de la ciudad y acudir a la Corte. Padilla fingió cumplir la orden real, el 15 de abril, pero el pueblo amotinado se lo impidió. Cuando la ciudad de Toledo proclamó la Comunidad, aun antes de la marcha del Rey, Padilla ya figuraba como uno de sus máximos dirigentes. A finales del mes de julio de 1520 se reunieron en Ávila los representantes de las ciudades de Toledo, Segovia y Salamanca; era el esbozo de la futura Junta de las Comunidades. El cardenal Adriano, gobernador del Reino en ausencia del Rey, ordenó al alcalde Ronquillo y al Ejército Real, capitaneado por Antonio de Fonseca, castigar la rebelión de Segovia. Juan de Padilla se puso entonces al frente de las milicias de Toledo y se dirigió hacia Segovia para socorrerla. El 24 de agosto de 1520, Padilla y los toledanos entraron en Medina del Campo que el Ejército Real acababa de incendiar. Pocos días después, el 29 de agosto, se trasladó a Tordesillas donde a la sazón residía la reina Juana. Padilla y los comuneros pretendían liberar a la Reina de su cautiverio y devolverle el trono, acatándola como la soberana legítima de Castilla. Doña Juana dio audiencia varias veces a los capitanes comuneros, pero se negó rotundamente a firmar cualquier orden escrita. De Tordesillas, Padilla pasó a Valladolid donde procedió a la detención de los miembros del Consejo Real. Cuando, el 24 de septiembre, se reunió en Tordesillas la Santa Junta formada por representantes de casi todas las ciudades de voz y voto en Cortes, Juan de Padilla gozó en toda Castilla de una popularidad inmensa; el cronista Gonzalo de Ayora, también comunero, se hizo eco de aquella fama y “piensa dejar la memoria de Juan de Padilla inmortal”. Pero la mayoría de la Junta parecía desconfiar de él y, el 11 de octubre, prefirió dar el mando del ejército comunero a un noble, Pedro Girón, nombrado capitán general. Despechado, Padilla se retiró entonces a Toledo. [...]